رنگ آمیزی پاپ اسمیر (Pap smear staining) یا رنگ آمیزی پاپ (Pap staining) یکی از پرکاربردترین رنگ آمیزی های اختصاصی در سیتولوژی و هیستولوژی است که به متخصصین پاتولوژیست جهت تشخیص بیماری های مربوط به دهانه رحم (Cervical) مخصوصا سرطان دهانه رحم کمک گسترده ای کرده است. اساس رنگ آمیزی پاپ اسمیر استفاده از چندین رنگ و ایجاد تمایز بین سلولها و اجزای مختلف سلولهای اسمیر نمونه های مورد بررسی روی اسلایدهای میکروسکوپی می‌باشد. این تکنیک متداول‌ترین رنگ آمیزی اجزای سلولی در اسمیر سلولهای لایه برداری شده، واژینال، دهانه رحم، مایع نخاعی و غیره است.
سه ویژگی و تمایز اصلی در تکنیک رنگ آمیزی پاپ اسمیر سبب شده تا محققین حوزه سرطان شناسی و پاتولوژیست ها در حوزه تشخیصی درمانی، به این تست توجه ویژه ای داشته باشند. این ویژگی ها عبارتند از:
• در این تکنیک هسته سلولها در نمونه را رنگ کرده و در نتیجه در شناسایی ناهنجاریهای هسته سلول های سرطانی کمک ویژه‌ای می کند.
• سیتوپلاسم سلولها را رنگ‌آمیزی می‌کند. بنابراین مشاهده سلولها را تسهیل می بخشد.
• رنگ‌آمیزی پاپ اسمیر سبب تمایز و شناسایی بین انواع سلولها مانند سلولهای اسیدوفیل و بازوفیلی می شود.
انواع کاربردهای رنگ آمیزی اختصاصی پاپ اسمیر در بافت شناسی
تکنیک هیستولوژی رنگ آمیزی پاپ اسمیر، رنگ آمیزی چند رنگی، که در حوزه پاتولوژی تشخیصی و تحقیقاتی بسیار مورد توجه قرار گرفته است. از این تکنیک رنگ‌آمیزی جهت تمایز سلولها در مایعات مختلف بدن استفاده می شود. رنگ آمیزی پاپ در حوزه تشخیصی و تحقیقاتی سرطان شناسی در تشخیص بدشکلی های سلولهای دهانه رحم مرتبط با انواع بیماری‌ها نیز کاربرد دارد. از جمله این بیماری‌ها عبارتند از سرطان سرویکس، زخم ها در نارسایی سرویکس، سروسیت یا التهاب رحم، دیسپلازی دهانه رحم، پولیپ‌های دهانه رحم و عفونت ویروس پاپیلومای انسانی.
کاربرد رنگ آمیزی پاپ اسمیر در تشخیص و مطالعه انواع تومورها
بافت دهانه رحم رنگ شده با پاپ اسمیر
در دستگاه تناسلی زنان، در قسمت پایینی رحم ، دهانه رحم یا سرویکس به عنوان یک اندام فیبرو عضلانی است که حفره رحم را به واژن متصل می کند. دهانه رحم یا سرویکس غالبا از بافت رشته‌ای-عضلانی تشکیل شده و شامل دو قسمت اکتوسرویکس و اندوسرویکس می‌باشد. مرز همپوشانی بین کانالهای اندوسرویکس و اکتوسرویکس را ناحیه تبدیل (transformation zone) می‌نامند که نمونه برداری برای رنگ آمیزی پاپ از همین ناحیه انجام می‌شود. کانال آندوسرویکس با سلولهای اپیتلیوم ترشح کننده پوشانده شده است و اکتوسرویکس با سلولهای اپیتلیال سنگفرشی پوشیده شده است. هنگامی که سلولهای اپیتلیال طبیعی به غیرمعمول و دیسپلاستیک تبدیل شوند ممکن است بعد از چندین سال با تکثیر سلولهای غیرطبیعی در بافت منجر به سرطان تهاجمی شود.
بافت دهانه رحم پوششی از سلولهای ترشح کننده مخاط دارد که در صورت تغییرات فیزیولوژی و مورفولوژی در سلولهای این بافت منجر به بروز اختلال در تولید مایع مخاطی می شود. بافت سرویکس مانند هر بافت دیگری می‌تواند دچار سرطان شود. علاوه بر سرطان یا کانسر سرویکس، ممکن است پولیپ سرویکال، سرویسیت یا کیست نابوتین در سرویکس نیز بروز کند.
انواع نمونه‌های بافتی تشخیصی و مورد مطالعه با رنگ آمیزی اختصاصی پاپ اسمیر
در رنگ آمیزی اختصاصی پاپ اسمیر نمونه های متنوع مانند مایع مخاطی بدن، ادرار، مایع مغزی-نخاعی، مواد آسپیراسیون با سوزن ظریف، بیوپسی بافت و نمونه‌های توموری، یا سایر مواد حاوی سلول رنگ آمیزی می شوند. رایج‌ترین نمونه در این تکنیک، سلولهای دهانه رحم است که معمولا بعد از نمونه‌گیری سلولها به محلول نگهدارنده منتقل می‌شود.
پروتکل رنگ آمیزی اختصاصی پاپ اسمیر در بافت‌شناسی
همانطور که توضیح داده شد، رنگ آمیزی پاپ یا رنگ آمیزی پاپانیکولائو یک تست پلی‌کروماتیک یا چند رنگی است که شامل رنگ های اسید و بازی هستند. این رنگها عبارتند از:
رنگ هماتوکسیلین( Hematoxylin)
رنگ اورنج گرین G (Orange Green G)
رنگ ائوزین آزور (Eosin Azure)
رنگ Light green SF
رنگ Bismarck brown Y
کلیه رنگ های ذکر شده در سه محلول اضافه می شوند. هر یک از رنگها جزئی از سلول را رنگ‌آمیزی می کند.
مراحل آماده سازی لام از نمونه بافتی در رنگ آمیزی اختصاصی پاپ اسمیر
هنگامی که نمونه مورد بررسی بافت است ابتدا می بایست بافت طی یک سری مراحل فیکس گردد.
آبگیری بافت:
فرایند آبگیری بافت با غوطه‌ور کردن بافت ها در اتانول انجام می شود. اتانول جایگزین آب در سلولهای نمونه بافتی می شود. از افزایش غلظت اتانول (معمولاً از ۷۰ تا % ۱۰۰) در این مراحل استفاده می‌شود.
قالب‌گیری بافت:
بعد از آبگیری، پارافین مذاب با دستگاه پارافین دیسپنسر در تیشوبسکت ها می ریزیم. تکه های بافت را در تیشوبسکت حاوی پارافین مذاب قرار داده و قالب گیری کرده و اضافه های پارافین را حذف می‌کنیم نهایتا بلوکهای پارافینی جامد از بافت داریم. پس از خنک شدن پارافین، قالب نمونه را در آب فرو می بریم. نهایتا پارافین که منجمد شد می بایست آن را از قالب جدا کنیم.
برش‌گیری از بلوک پارافینی:
در این مرحله از نمونه پارافینی با دستگاه میکروتوم برشهای نازک در حد ۳-۵ میکرون تهیه می کنیم.
آبدهی نمونه برش زده:
برشهای نمونه بافتی را روی لام قرار داده و سپس پارافین های اضافی نمونه ها را حذف می کنیم و با غلظت های مختلف از اتانول نمونه ها را آبدهی می‌کنیم.
اکنون لام های آماده شده را طبق پروتکل رنگ آمیزی پاپ رنگ می‌کنیم.
اگر نمونه تهیه شده سلولهای اپیتلیال در محلول نگهدارنده یا مایعات بدن است دیگر نیازی به انجام مراحل بالا نیست و می بایست از نمونه مورد نظر روی لام گسترش تهیه نمود.
روش انجام رنگ آمیزی پاپ اسمیر به دو نوع progressive و regressive انجام می شود. در روش progressive ، هسته به رنگ آبی طبق شدت رنگی که نیاز است، رنگ آمیزی می شود. در این روش، استفاده از رنگ های Mayer Hematoxylin و Gill’s hematoxylin ترجیح داده می شود.
در روش دوم (regressive) لام تهیه شده با رنگ هماتوکسیلین غیر اسیدی بسیار پرنگ رنگ آمیزی می شود. رنگ های اضافی با محلول اسیدی HCl رقیق شده حذف می شود. Harris Hematoxylin برای روش دوم ترجیح داده می شود. زمان‌بندی در این روش بسیار مهم است، زیرا رنگ‌زدایی ممکن است منجر به هایپوکرومیک شدن هسته‌های هیپرکروماتیک شود.
روش progressive رایج ترین روشی است که امروزه در آزمایشگاه ها مورد استفاده قرار می گیرد. کنترل و ستاپ آن آسان‌تر است. رنگ‌آمیزی معمولی زمان‌بر بود، از این روش اول یعنی رنگ‌آمیزی سریع پاپ ایجاد شد.
تفسیر نتایج رنگ آمیزی پاپ اسمیر
در رنگ آمیزی پاپ یا پاپ اسمیر از چند رنگ اسیدی و بازی برای رنگ آمیزی قسمت های مختلف اسیدی و بازی سلولهای فیکس شده روی لام های میکروسکوپی استفاده می شود. تمایز اجزای مختلف سلول ها در نتیجه انجام تکنیک رنگ آمیزی پاپ اسمیر سبب شده تا از آن در تحقیقات علمی پاتولوژی بویژه سرطان دهانه استفاده ویژه شود.
در این تکنیک هسته سلولها را آبی رنگ کرده و در نتیجه ناهنجاریهای هسته سلولهای سرطانی از سلولهای طبیعی قابل شناسایی است.
سلولهای اسیددوست قرمز رنگ می شوند.
سلولهای بازوفیل سبز-آبی رنگ آمیزی می شوند.
اریتروسیت ها به رنگ نارنجی متمایل به قرمز مشاهده میشوند.
ائوزینوفیل ها نارنجی متمایل به قرمز رنگ می شوند.
قارچ کاندیدا در نمونه هدف قرمز رنگ آمیزی می شود.
تریکوموناس (Trichomonas) به رنگ سبز یا خاکستری قابل مشاهده است.
سلولهای Superficial صورتی و سلولهای Parabasal و Intermediate سبز- آبی رنگ آمیزی می شوند. سلولهای Superficial بزرگترین سلولها در اسمیر نمونه واژن هستند و نسبت به Parabasal و Intermediate تکامل یافته تر می باشند.
کراتین سلولها با رنگ زرد و نارنجی قابل تمایز است.
در نتایج حاصل از رنگ آمیزی پاپ اسمیر در نمونه های اسمیر از سرویکس، ASCUS ( Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance) مورد توجه بسیاری از پاتولوژیست ها و محققان سرطان شناسی قرار گرفته است. از آنجایی که تغییرات سلولی در ASCUS ممکن است منعکس کننده یک تغییر خوش خیم یا یک ضایعه جدی باشد، تشخیص و تفسیر آنها پراهمیت می باشد. در شکل شماره ۳ بزرگ شدن هسته در سلول های سنگفرشی Superficial و Intermediate مشاهده می شود. هسته ها ۲.۵ تا ۳ برابر اندازه یک هسته طبیعی بزرگ می شوند و ممکن است هیپرکرومازی (hyperchromasia )خفیف با کروماتین دانه¬ای و یکنواخت داشته باشند. بی نظمی های غشای هسته ای رایج نیستند.
رنگ آمیزی پاپ اسمیر سلول های Intermediate سنگفرشی غیرنرمال را با بزرگ شدن هسته و هیپرکرومازی خفیف با بزرگنمایی ×۴۰۰ میکروسکوپ نوری نشان می دهد.
رنگ آمیزی پاپانیکولائو (پاپ اسمیر) یک تکنیک رنگ آمیزی روتین است که معمولاً در آزمایشگاه های پاتولوژی دهان کاربرد دارد. این رنگ برای تمایز سلول ها در اسمیر ترشحات مختلف بدن استفاده می شود. کاربرد اصلی رنگ G6 نارنجی در رنگ پاپانیکولائو برای رنگ آمیزی کراتین است. سلول های سطحی با مقادیر بالای کراتین رنگ زرد-نارنجی و سلول های Parabasal به رنگ سبز تا آبی رنگ می شوند. هسته ها آبی تیره، سیتوپلاسم آبی روشن تا تیره، دسموزوم ها سبز رنگ شدند. در شکل شماره کارسینومای سلول سنگفرشی یک نئوپلاسم است که در نمونه بیمار اعتیاد به تنباکو و الکل مشاهده می شود.
رنگ آمیزی پاپانیکولائو کارسینومای سلول سنگفرشی را نشان می دهد. ۱-لایه سلول پایه، ۲-لایه اسپینوزوم،
۳- بافت همبند و ۴- کراتین ها. با بزرگنمایی ۴۰۰ برابر.
