آزمایش Panel Reactivity Ab با روش سرولوژی به دو صـــورت
WBC Cross match with Doner وWBC cross match with panel قابل انجام است .
مراحل انجام کار در هر دو روش کاملاً مشابه است، بجز تفاوت جزئی که در آخر به آن می‌پردازیم.
خونی که در این روش استفاده می‌شود خون تام و بدون ضدانعقاد است که البته دفیبرینه شده است.
از آنجا که در این روش از کمپلمان جهت لیز سلولی استفاده می‌شود، خون نمی‌تواند حاوی ضدانعقادهایی نظیر EDTAو سیترات سدیم باشد چراکه این دو ضدانعقاد ضمن فعالیت خود یونCA ++ را که برای شروع فعالیت کمپلمان الزامی است به مصرف می‌رسانند.
استفاده از ضدانعقاد هپارین درصورتی‌که نمونه خون از آزمایشگاه دیگری ارسال می‌شود بلامانع است، اما باید دانست که هنگام جداسازی لنفوسیت‌های نمونه خون، حضور پلاکت‌ها در خونی که با هپارین همراه است باعث اختلال می‌شود که باید به کمک شستشو با بافر Hanks پلاکت‌ها حذف شوند.
جهت جداسازی لنفوسیت‌ها از محلول فایکول استفاده می‌کنیم. فایکول ترکیب کربوهیدراتی است که با نسبت مناسبی از پودر فایکول و سدیم دیاتروزوات در آب تهیه می‌شود.
چگالی فایکول از آب مقطر بیشتر و حدود ۰۷۷/۱ است و این امر باعث می‌شود که به کمک این محلول اجزای مختلف خون از هم جدا شوند. این اجزا از بالا به پایین شامل سرم، هاله لنفوسیتی، محلول فایکول، لایه بسیار نازک بافی‌کوت و گلبول‌های قرمز می‌باشد.
پس از اینکه هاله لنفوسیتی جدا شد، این لنفوسیت‌ها به محلول شستشوی Hanks اضافه می‌شوند.
Hanks محلول قندی- نمکی شستشوی لنفوسیت است.
این محلول یک مایع استریل است که حاوی ترکیبات مختلفی مانند بی‌کربنات سدیم، کلرید سدیم، کلرید پتاسیم، فسفات پتاسیم مونوبازیک، فسفات سدیم دی‌بازیک و گلوکز می‌باشد. از این محلول جهت تهیه سوسپانسیون لنفوسیتی استفاده می‌شود.
در ادامه پس از بررسی تعداد لنفوسیت‌ها به کمک لام نئوبار، لنفوسیت‌های افراد سالم در پلیت‌های مخصوصی تحت عنوان پلیت تراساکی و فضای پوشیده از Cover oil به‌صورت قطره‌ای شناور با سرم گیرنده پیوند مجاور می‌شوند.
همزمان از دو سرم کنترل مثبتALG (Anti Lymphocyte Globulin) و کنترل منفی AB نیز استفاده می‌شود. پس از طی شدن زمان انکوباسیون در دمای اتاق به مدت ۳۰ دقیقه، کمپلمان اضافه می‌شود.
درصورتی‌که در بدن گیرنده پیوند Ab پیش‌ساخته علیه HLA موجود در سطح لنفوسیت‌ها حضور داشته باشد و کمپلکسAg-Ab بوجود آمده باشد، کمپلمان وارد عمل شده و سلول را لیز می‌کند.
جهت بررسی هرچه بهتر این پدیده پس از گذشت زمان انکوباسیون در دمای اتاق به مدت ۲ ساعت از رنگ ائوزین و نگهدارنده فرمالین استفاده می‌شود.
درنهایت پس از گذشت ۱۵ دقیقه می‌توان به کمک میکروسکوپ معکوس (Invert) میزان لیز سلولی را به‌صورت درصد گزارش کرد.
نحوه گزارش نتیجه آزمایش
ازآنجاکه گزارش درصد لیز سلولی در این روش به‌صورت کیفی است، حضور سرم کنترل مثبت و منفی در نحوه صحیح گزارش کمک‌کننده است.
سلول‌های لیزشده در مقایسه با سلول‌های سالم اندازه‌ای بزرگ‌تر و انکسار نور کمتری دارند. هم‌چنین نمونه‌های لیز شده به دلیل خروج محتویات سلول، زمینه‌ای کدر دارند.
گزارش نهایی به‌صورت درصدی از سلول‌های لیز شده در هر چاهک گزارش می‌شود. میزان لیز سلولی تا ۲۰% قابل‌قبول است اما درصورتی‌که این درصد افزایش داشته باشد نمونه بیمار باید مجدداً با تعداد سلول بیشتری تحت آزمایش قرار بگیرد.
لازم به ذکر است در روش WBC Cross match with Doner سرم گیرنده به‌طور اختصاصی با لنفوسیت‌های دهنده پیوند، مجاور می‌شود.
در روش فلوسایتومتری، مقادیر اندکی از سرم بیماران با دانه‌های نشان‌دارشده با ماده فلورسنت و پوشیده از مولکول‌هایHLA مشخص، مخلوط می‌شوند. مولکول‌های HLA مزبور نماینده آلل‌های HLA که ممکن است در عضو پیوندی وجود داشته باشند، خواهند بود. هر آلل HLA به یک دانه با ماده فلوئورسنت متفاوت متصل است. اتصال آنتی‌بادی‌های بیمار به دانه‌ها با فلوسایتومتری تعیین می‌شود . نتایج به‌صورت درصد آنتی‌بادی واکنش‌دهنده (PRA)، که مقدار درصد آلل HLA که سرم بیمار با آن واکنش داده است، گزارش می‌گردد.
آنچه مسلم است روش فلوسایتومتری به دلیل وجود سیستم خودکار و عاری از نیروی انسانی در مقایسه با روش Panel Reactivity Ab از دقت بیشتری برخوردار است.
گزارش نتایج به‌صورت کیفی، هم‌چنین یافتن سلول لنفوسیت مراجعه‌کننده نرمال و زمان نسبتاً طولانی انجام تست به‌واسطه زمان‌های انکوباسیون طولانی از معایب روش Panel Reactivity Abبشمار می‌رود؛
با این همه در دسترس بودن این تست نسبت به روش فلوسایتومتری و هزینه کمی که برای بیماران ایجاد می‌کند باعث شده همچنان در مراکز آزمایشگاهی پیوند کلیه مورد استقبال قرار بگیرد.
این نوع آنتی‌بادی‌ها که ممکن است تولید آن‌ها پیامد حاملگی‌های قبلی، انتقال خون یا عمل پیوند عضو باشد، می‌توانند خطر رد فوق حاد یا رد حاد رگی را تعیین نمایند. این آزمایش هم‌اکنون در کشور ما به دو صورت سرولوژی و فلوسایتومتری انجام می‌شود
اشتراک
