ایمونوهیستوشیمی IHC

ایمونوهیستوشیمی ( immunohistochemistry) که به اختصار IHC نیز نامیده می شود ترکیبی از هیستولوژی و ایمونولوژی است، یک تکنیک آزمایشگاهی که آسیب شناسان برای جستجوی علائم بیماری در نمونه بافت استفاده می کنند.

در IHC از خواص آنتی‌ژن‌یابی آنتی‌بادی‌ها برای شناسایی و گرفتن آنتی‌ژن‌ها در نمونه بافت استفاده می‌کند. آنتی بادی ها نمونه را رنگ آمیزی می کنند تا پاتولوژیست بتواند آنتی ژن هایی را که در زیر میکروسکوپ به آنها متصل شده است ببیند.

پزشکان معمولاً از IHC برای تشخیص سرطان استفاده می کنند، اما می تواند شرایط دیگری از جمله بیماری آلزایمر، بیماری پارکینسون و دیستروفی عضلانی را نیز تشخیص دهد.

همچنین می توانند پاتوژن هایی را که باعث عفونت می شوند شناسایی کند. اولین رنگ آمیزی موفق IHC در سال 1941 رخ داد، زمانی که محققان Coons) و همکاران) باکتری های مرتبط با ذات الریه (پنوموکوک) را در یک نمونه بافت شناسایی کردند.

مانند دیگر تکنیک های ایمونواسی ، ایمونوهبستوشیمی شامل سه بخش مهم است : آنتی بادی ها، سیستم های تولید سیگنال برای ردیابی و فاز جامد که واکنش ها در بستر آن انجام می شود.

روش کار تست:

در تکنیک IHC از آنتی بادی ها برای تشخیص آنتی ژن هدف در نمونه بافت استفاده می کند. آنتی ژن هدف یک نشانگر است که نشان دهنده وجود یک بیماری خاص است. اگر آنتی بادی آنتی ژن را تشخیص دهد، به آن متصل می شود. فرآیند اتصال شبیه به قفل (آنتی ژن) و کلید (آنتی بادی) است.

در این روش ، یک آنتی بادی را به آنزیمی پیوند می دهند که اگر آنتی بادی به آنتی ژن هدف متصل شود، واکنش نشان می دهد. اتصال باعث واکنش آنزیم می شود. این واکنش باعث می شود که نمونه بافت در زیر میکروسکوپ به رنگ خاصی نشان  داده شود.

 اتصال  آنتی ژن به آنتی بادی می تواند مستقیم ( یک مرحله ای) یا غیر مستقیم (دو مرحله ای) باشد.

در روش مستقیم، آنتی بادی اختصاصی آنتی ژن بافت به آنزیم متصل است آنزیم ها در مجاورت با سوبسترا تولید رنگ میکنند که در زیر میکروسکوپ نوری قابل مشاهده است.

در روش غیر مستقیم آنتی بادی اختصاصی آنتی ژن به بافت متصل شده و بعد از آن آنتی بادی ثانویه را اضافه می کنیم که به آنتی بادی اولیه می چسبد و از طرف دیگر هم به آنزیم کونژوگه است. این کار باعث تقویت رنگ تولید شده توسط سوبسترا می شود.

نمونه های مورد استفاده:

• بافت های پارافینه

بافت های مورد استفاده برای IHC از افراد متوفی یا زنده جمع آوری می شوند و ممکن است منشأ حیوانی یا انسانی باشند. به محض  برداشتن بافت ، تغییراتی در بافت ایجاد می شود که می تواند اثرات مهمی روی آنتی ژن داشته باشد. شروع زودرس هیپوکسی ، تغییر در pH و آنزیم های لیزوزومی می تواند اثرات بسیار مضر بر حفظ آنتی ژن داشته باشد. مراحل بعدی تخریب شامل تخریب بافت توسط باکتری ها و قارچ ها است که منجر به از دست رفتن ناخالص هر دو آنتی ژن و مورفولوژی سلولی می شود.

بنابراین ضروری است که بافتها ، یا به طور خاص آنتی ژن هایی که توسط ایمونوهیستوشیمی نشان داده می شوند ، در حالت داخل بدن تا حد ممکن حفظ شوند. این امر با فرایندی که “تثبیت” نامیده می شود ، حاصل می شود. فیکساتور معمولاً به بافت نفوذ می کند و با ایجاد تغییرات در ساختار سوم پروتئین آنها را از لحاظ بیولوژیکی غیرفعال می کند. یکی از رایج ترین فیکساتورها فرمالین است. این بافت ها در فرمالین نگهداری می شوند و پس از مراحل پردازش به منظور حفظ شکل و ساختار آنتی ژن ها در پارافین قالب بندی می شوند. و سپس با دستگاه میکروتوم برش های نازک حدودا 4 میکرومتر تهیه می شود. این نمونه ها را می توان تا چند سال در دمای اتاق نگهداری کرد.

• بافت های فریز شده:

این بافت ها بعد از جدا شدن از موجود زنده به سرعت فریز شده و برش داده می شوند. در این روش چون مراحل پردازش بافت وجود ندارد مناسب آنتی ژن هایی است که نسبت به تغییرات محیطی مثل قرار گرفتن در فرمالین و یا حرارت حساس هستند. در مواردی نیز که سرعت تشخیص اهمیت دارد از این روش استفاده می شود. برای مثال در اتاق های عمل بعد از برداشتن بافت های توموری برای تشخیص سریع مورفولوژی سلول ها ، نوع و grade سرطان ، بررسی مارکرهای متاستازی و… نمونه بیمار را به بخش پاتولوژی می فرستند و در مدت کوتاهی جواب را تحویل می گیرند.

دقت ایمونوهیستوشیمی (IHC):

هنگامی که به درستی و با کنترل های کیفی انجام شود، ایمونوهیستوشیمی یک روش قابل اعتماد برای تشخیص سرطان است. یک مطالعه گزارش می دهد که IHC می تواند محل اولیه سرطان متاستاتیک را با دقت 70 تا 90 درصد به دقت شناسایی کند.

کاربردهای ایمونوهیستوشیمی

از آنجایی که ایمونوهیستوشیمی شامل واکنش های اختصاصی آنتی ژن-آنتی بادی است، نسبت به تکنیک های سنتی رنگ آمیزی که تنها تعداد محدودی از پروتئین ها، آنزیم ها و ساختارهای بافت را مشخص می کند دارای برتری می باشد. بنابراین IHC به یک تکنیک ضروری تبدیل و به طور گسترده ای در بسیاری از آزمایشگاه های تحقیقاتی پزشکی و همچنین تشخیص بالینی مورد استفاده قرار می گیرد.

در ادامه مطلب چند مورد از استفاده های ایمونوهیستوشیمی را به طور بسیار خلاصه توضیح خواهیم داد.

• مارکرهای پیش آگهی دهنده در سرطان

برای تعیین پیش آگهی تومورها از طریق شناسایی آنزیم ها، آنتی ژن های اختصاصی تومور، انکوژن ها، ژن های سرکوب کننده تومور و مارکرهای تکثیر سلولی تومور از ایمونوهیستوشیمی استفاده می شود.

برخی از این پروتئین‌ها شامل موارد زیر هستند:
* Ki-67: شاخص تکثیر سلولی که می‌تواند سرعت رشد تومور را نشان دهد.
* p53: پروتئین مرتبط با تنظیم چرخه سلولی و مرگ برنامه‌ریزی شده سلولی (آپوپتوز)

تجزیه و تحلیل تومورها با استفاده از این روش ها، نسبت به روش های قدیمی تشخیصی و تعیین بالینی درجه بندی تومور پیشرفت قابل ملاحظه ای نشان داده است.

• تشخیص نوع و منشاء سرطان

با استفاده از مارکرهای اختصاصی تومور، پزشکان از IHC برای تشخیص سرطان (نوع خوش خیم یا بدخیم)، مرحله و درجه تومور، نوع سلول سرطانی و منبع متاستاز را تعیین کرده و بدبن ترتیب قادر به یافتن محل تومور اولیه می باشند.

 به عنوان مثال:
* کارسینوم: ایمونوهیستوشیمی می‌تواند به شناسایی سلول‌های اپیتلیالی کمک کند.
* سارکوما: شناسایی سلول‌های مزانشیمی (مانند سلول‌های عضلانی و استخوانی)
* لنفوم: شناسایی انواع مختلف لنفوسیت‌ها در تومورهای سیستم لنفاوی.

درجدول زیر مهمترین  مارکر های تشخیصی  برخی از سرطان ها آورده شده است:

• تومورهای با منشاء نامشخص

پنل های مختلف تکنیک IHC امکان شناسایی تومورهایی با منشاء نامشخص و همچنین فرم متاستاتیک تومور با منشاء اولیه نامشخص را فراهم نموده است. پنل های مختلف آنتی بادی جهت رفع چنین مشکلات تشخیصی انتخاب می گردد.  انتخاب آنتی بادی ها، بر اساس تاریخچه بالینی، ویژگی های مورفولوژیکی و بررسی های پاتولوژی بر روی لام H&E و نتایج سایر تحقیقات مربوطه می باشد.

· پیش بینی پاسخ به درمان

 
IHC می‌تواند برای ارزیابی پاسخ تومورها به درمان‌های خاص استفاده شود. به عنوان مثال، کاهش بیان مارکرهای تکثیری مانند Ki-67 پس از درمان می‌تواند نشان‌دهنده مؤثر بودن درمان باشد.

• تعیین زیرگروه‌های مولکولی
  در برخی سرطان‌ها، مانند سرطان پستان و سرطان ریه، IHC می‌تواند زیرگروه‌های مولکولی خاصی را شناسایی کند که به انتخاب درمان مناسب کمک می‌کند:
  * سرطان پستان: شناسایی گیرنده‌های استروژن (ER)، گیرنده‌های پروژسترون (PR) و گیرنده‌های HER2. این مارکرها به تعیین درمان‌های هورمونی و هدفمند کمک می‌کنند.
  * سرطان ریه: شناسایی مارکرهایی مانند ALK، ROS1 و PD-L1 که می‌توانند در انتخاب درمان‌های هدفمند و ایمنی‌درمانی مؤثر باشند

· عفونت ها

روش های ایمونوهیستوشیمی برای تأیید اهداف عفونی در عفونت هایی نظیر سایتومگالوویروس، ویروس هپاتیت B، ویروس هپاتیت C به کار می رود. این روند شناسایی در بافت براساس استفاده از آنتی بادی های اختصاصی علیه DNA یا RNA میکروبی و سایر پارامترهای میکروبی می باشد. این برنامه به طور منظم در اعتبار سنجی اهداف بیماری از طریق ردیابی بیان این اهداف در بافت های آسیب دیده در طول بیماری مورد استفاده قرار می گیرد.

ازجمله مزایای IHC قابلیت ردیابی ارگانیسم ها در نمونه های سیتولوژیکی نظیر مایعات بدن، نمونه های بزاق و نمونه های آسپیره شده به وسیله سوزن می باشد. این مورد می تواند در شرایط خاصی نظیر ردیابی پنوموسایتوزیس از نمونه بزاق بیمارانی با نقص ایمنی که نیازمند درمان سریع و به موقع می باشند، مورد استفاده قرار گیرد.

· ژنتیک

از تکنیک ایمونوهیستوشیمی می توان در تعیین عملکرد برخی ژن های خاص در پروسه های بیولوژیکی ابتدایی – نظیر آپوپتوز – و گسترش بیان ژن استفاده نمود. به عنوان مثال می توان با استفاده از یک آنتی بادی مونوکلونال اختصاصی علیه همولوگ p53در مسیر پروآپوپتوتیک p53 جهت ردیابی آن استفاده نمود.

· اختلالات نوروژنیک

اختلالات تخریب سیستم عصبی شامل طیف گسترده ای از بیماری هایی است که با اختلال عملکرد و مرگ جمعیت خاصی از سلول های عصبی آسیب پذیر و حساس مشخص می گردد. این نقش به طور فزاینده ای در طبقه بندی اختلالات نوروژنیک و توسعه معیارهای مهم برای تشخیص آنها حائز اهمیت می باشد و ایمونوهیستوشیمی می تواند به این تشخیصها کمک کند.

· ترومای مغزی

در چند سال گذشته، رنگ آمیزی ايمونوهيستوشيمی برای پروتئين پيش ساز بتا آميلوئيد به عنوان يک روش جهت تشخيص آسيب آکسونی در مدت زمان 2 تا 3 ساعت پس از آسيب سر مورد تأیید قرار گرفته است. تشخیص ايمونوهيستوشيميايی آسيب آکسونی می تواند در تنظيم زمان تروما در پزشکی قانونی مورد استفاده قرار گیرد.

· ایمونوهیستوشیمی و کاربردهای آن در بیماری های عضلانی

تشخیص خاص دیستروفی عضلانی به دلیل پیامدهای ناشی از بیماری های ارثی و پیش بینی دقیق آن ها حائز اهمیت می باشد. در سال های اخیر، در دیستروفی های عضلانی اختلالات متعددی در پروتئین های عضلانی تأیید شده است. چنین اختلالاتی پروتئین های عضلانی واقع در سارکولم، ماتریکس خارج سلولی، سیتوزول، هسته و سایر بافت های شامل فیبرهای عضلانی را هدف قرار می دهد.

بیوپسی عضلانی اسکلتی می تواند نقش مهمی در تشخیص دیستروفی عروق از اختلالات غیر دیستروفیک ایفا کند و IHC می تواند در تشخیص خاصی از دیستروفی ها با منشاء متفاوت پروتئینی کمک کننده باشد.

• شناسایی پروتئین‌های مرتبط با درمان هدفمند

برخی پروتئین‌ها می‌توانند به عنوان اهداف درمانی خاص در سرطان‌ها عمل کنند.

IHC می‌تواند به شناسایی این پروتئین‌ها کمک کند و به پزشکان اطلاعات مهمی برای تصمیم‌گیری در مورد استفاده از داروهای هدفمند ارائه دهد.

مثال‌های کاربردی:
 سرطان پستان:  ER و PR برای تعیین استفاده از هورمون‌درمانی.
 HER2 : برای تعیین استفاده از داروهای هدفمند مانند تراستوزوماب.
  لنفوم‌ها CD20: برای تعیین استفاده از ریتوکسیماب.
 ملانوما PD-L1: برای تعیین استفاده از ایمنی‌درمانی‌های مبتنی بر مهارکننده‌های چک‌پوینت

· برنامه های تحقیقاتی ایمونوهیستوشیمی و کاربردهای آن

بخشی از تحقیقات کنونی در رابطه با علل بیماری های تخریبگر نورون به شناسایی عوامل ایجاد کننده رشته های اسپیرالیک دوتایی، رسوب بتا آمیلوئید، تجمع سیتوپلاسمی و غیره می پردازد. در نتیجه، انجام چنین مطالعاتی جهت تشخیص و تعیین میزان پروتئین های غیر طبیعی که منجر به بروز بیماری های تخریب گر نورون می شوند دارای اهمیت بالایی می باشد.

IHC با استفاده از آنتی بادی هایی علیه بتا آمیلوئید،  synuclein  آلفا، یوبی کوئیتین، هانتینگتین، پلی گلوتامین و دیگر مارکرها تبدیل به یک ابزار معمول برای تشخیص دقیق و تعیین کمی پروتئین های غیر طبیعی در هر دو بافت انسان و حیوانات آزمایشگاهی گردیده است. از این رو IHC ابزار مهمی در آزمایشگاه های تشخیصی و تحقیقاتی می باشد.

در آزمایشگاه تشخیص طبی راز  در بخش پاتولوژی ‍‍‍‍‍‍ از  ایمونوهیستوشیمی به عنوان یکی از راه های اصلی برای بررسی حضور بیومارکرها در بافت به منظور تشخیص سرطان ها ، مطالعه فرآیند پاتوژنز بیماری‌ها، تشخیص ماهیت سلولها ، نوع بافت ، تعیین اولیه یا متاستاتیک بودن توده ، موارد پروگنوستیک و اهداف درمانی استفاده می شود.

مارکر های ایمونوهیستوشیمی قابل ارائه در آزمایشگاه پاتوبیولوژی  راز شیراز  در جدول زیر آورده شده است:

مرکز تخصصی راز شیراز، یکی از بهترین آزمایشگاه‌های شیراز برای

انجام این آزمایش ها است. نتایج آزمایش‌ها در این مرکز با رعایت دقیق کلیه استانداردها، دارای حداکثر دقت است. تخصص و مهارت نیروهای تیم راز، و کیفیت و دقت دستگاه‌های بکار رفته در آزمایشگاه راز، آن را تبدیل به یکی از مجهزترین مراکز آزمایشگاهی بخش خصوصی دراستان فارس کرده است.

همکاران ما در آزمایشگاه راز شیراز با شماره تلفن‌های 07132369393-6 و یا از طریق واتساپ با شماره 09914444130 منتظر دریافت سؤالات و راهنمایی شما در این زمینه هستند.

تهیه کننده :

مرضیه آزاد ، کارشناس ارشد ایمنی شناسی پزشکی -واحد تحقیق و توسعه آزمایشگاه پاتوبیولوژی راز

رفرنس :

 my.clevelandclinic , cancerquest