سیتوژنتیک

سیتوژنتیک 

 

سیتوژنتیک علم مطالعه ساختمان کروموزوم هاست. در این علم کروموزوم‌ها با استفاده از تکنیک‌های باندینگ (نوارگذاری) یا شیوه‌های سیتوژنتیک مولکولی مورد تحلیل و بررسی قرار می‌گیرند. شاخه ای از ژنتیک است که با مطالعه ساختار و ترکیب کروموزومی یک سلول مرتبط است، که شامل آنالیز روتین کروموزومهای G-Band شده و سایر تکنیکهای بندینگ و نیز سیتوژنتیک مولکولی شامل FISH و CGH است.

 

ایمونوهیستوشیمی IHC

در ايمونوهيستوشيمي (IHC) با استفاده از آنتي بادي هاي مونوکلونال و پلي کلونال برای تشخیص و تعيين و توزيع آنتی ژن ها  استفاده می شود. آنتی ژن های اختصاصی تومور یا به صورت جدید بیان می شوند و یا در بدن افزایش بیان می یابند و با تشخیص آنها می توان به وضعیت سلامت سلولهای نمونه مورد نظر پی برد.

جهت انجام تکنینک ایمونوهیستوشیمی نیاز به نمونه برداری و بیوپسی می باشد. بعد از انجام پروسه ذوی پافت و تهیه نمونه به صورت بلوک پارافین ،نمونه ها با میکروتوم برش داده  می شوند و به روی لام منتقل می شوند. سپس این نمونه ها با یک آنتی بادی مناسب انکوبه می شوند. محل اتصال آنتی بادی به آنتی ژن را می توان به وسیله یک میکروسکوپ معمولی یا فلورسنت توسط مارکری مانند رنگ فلورسنت، آنزیم، عنصر رادیواکتیو یا طلای کلوئیدی ردیابی نمود.

این ماکرها به طور مستقیم به آنتی بادی اولیه یا آنتی بادی ثانویه متصل می باشند.

تکنیک  FISH

تکنیک هیبریداسیون در محل توسط Gall and Pardue و همچنین Jone و همکاران در سال ۱۹۶۹ ابداع گردید. این روش مکان یابی ژن ها یا توالی های RNA یا DNA را به مستقیم روی کروموزوم ها امکان پذیر ساخته است. در تکنیک FISH اسید های نوکلئیک تک رشته ای (معمولا DNA و گاهی اوقات RNA) با یکدیگر برهمکنش داده می شوند به طوری که کمپلکس ها یا هیبرید هایی را با ایجاد مولکول هایی با تشابه زیاد یا توالی های مکمل را تشکیل دهند. پس از هیبریداسیون اسید های نوکلئیک، میزان همسانی توالی ها تعیین می شود. در نتیجه، توالی های خاص شناسایی شده و روی کروموزوم های خاص مکان یابی می شوند

به طور خلاصه، این تکنیک جزو اولین تکنیک های هیستوشیمیایی است که شامل استفاده از دسته های مختلفی از رنگ های طبیعی و مصنوعی برای رنگ آمیزی ساختار های سلولی و اجتماعات درون سلولی می باشد. این ترکیبات عموما غیر اختصاصی بوده و برای دسته بندی مو لکول های خاص مانند پروتین ها، اسید های نوکلئیک، لیپیدها و کربوهیدرات ها به کار می روند. اولین هیبریداسیون در محل در اواخر دهه ۱۹۶۰ انجام گردید که در آن از مواد فلورسنتی خبری نبود و به جای آن از کاوشگر های نشان دار شده با رادیو ایزوتوپ ها استفاده شد. روش FISH برای تشخیص اسیدهای نوکلئیک نیز به کار می رود و جایگزینی برای روش های قدیمی است که از کاوشگرهای رادیو اکتیو استفاده می کردند. این روش، مستلزم هیبریداسیون کاوشگر اسید نوکلئیک با اسید نوکلئیک مورد نظر در محل (in situ) است.

 

تکنیک  Flowcytometry

 

سایتومتری (Cytometery) یا یاخته سنجی به معنای ‍سنجش و بررسی اجزای مختلف سلولی در یک نمونه است .دستگاه فلو سایتومتری(Flow cytometry ) اجزای متعدد سلولی را تعیین کرده و به صورت هم‌زمان آن‌ها را مورد شمارش قرار می‌دهد . خصلتهایی که توسط دستگاه فلو سایتومتری قابل اندازه‌گیری هستند عبارتند از اندازه سلول پیچیدگی سیتوپلاسمی محتوای DNA و RNAسلول و طیف گسترده‌ای از پروتیین‌های داخل سلولی ویا متصل به غشا می‌باشد .

در روش فلو سایتومتری سلول‌های رنگ آمیزی شده چه به وسیله آنتی بادی‌های مونوکلو نال متصل به فلورسنت و چه فلوروکرومهای متصل شونده به اجزای سلولی دریک جریان سیال قرار گرفته و به صورت تک تک از مقابل پرتو نوری (لیزر)عبور می‌کنند و متعاقب آن نور پراکنده شده و نور فلورسنس جانبی توشط آشکار سازها جمع‌آوری می‌شوند. این اشکار سازها سیگنالهای نوری را به سیگنالهای الکتریکی متناسب با نور جمع اوری شده تبدیل می‌کند . پراکنش نور در زاویه‌های مختلف می‌تواند سلول‌ها را بر اساس تفاوت در اندازه و پیچیدگی درونی از هم متمایز می‌کند در حالی که ساطع شدن نور از آنتی بادی‌های نشان دار شده با فلورسنت می‌تواند سلول‌ها را بر اساس تفاوت در آنتی ژن‌های سطحی و سیتو پلاسمی از هم تفکیک نماید .بدین ترتیب سلول‌ها بر اساس خصوصیاتی نظیر حجم گرانولاسیون و میزان رنگ‌پذیری از هم قابل افتراق داده می‌شوند .

 

ایمونوهیستوشیمی IHC


ایمونوهیستوشیمی برای تعیین آنتی ژنی خاص در بافت ، سلول ویا فاز خاصی از چرخه ی زندگی سلول بر پایه ی تشخیص آنتی ژن-آنتی بادی توسط میکروسکوپ نوری می باشد.
آنتی ژن پروتئینی است مربوط به ساختار سلول های مختلف ازجمله سلولهای اپیتلیالی عضلانی صاف عضلات مخطط سلول های لنفوئیدی و یا غیره

اهداف استفاده از ایمونوهیستوشیمی

در تشخیص ماهیت سلولها و نوع بافت
استفاده از ایمونوهیستوشیمی در در تومورهای کم تمایز یا بدون تمایز نقش بسزایی در تشخیص دارد.
گاهی افتراق لنفوم ازکارسینوم های اندیفرانسیه یا ملانوم بدخیم یا حتی سارکوما مشکل می شود. که در این موارد با استفاده از پانل مارکرهای مربوطه می توان به تشخیص نهایی رسید.
به عنوان مثال می توان با استفاده از مارکرهای Pan cytokeratin و LCA (CD45) بین لنفوم و تومورهای کارسینوم اندیفرانسیه افتراق داد.
یا برای افتراق تومورهای اپیتلیالی از ملانوم بدخیم میتوان از مارکرهای pancytokeratin Melan A , HMB45, استفاده کرده و تشخیص نهایی را داد.
همچنین برای تشخیص قطعی تومورهای نورواندوکرین می توان از مارکرهایی که ماهیت و منشا تومور را مشخص می کنند استفاده کرد و این موضوع از نظر تعیین نوع درمان جهت بیمار امری مهم محسوب می شود.
مارکرهای مورد استفاده درتشخیص تومورهای نورواندوکرین NSE Chromogranin, Synaptophysin می باشند.
تصویر روبه رو مربوط به رنگ آمیزی Synaptophysin در تومور نورواندوکرین می باشد.

 

 

روش PCR

این روش فوق العاده ساده بوده و با استفاده از تغییرات حرارت می‌توان چندین فرآیند را به دنبال همدیگر انجام داد. با این تکنیک می‌توان به عنوان یک روش قدرتمند تشخیص بالینی (Diagnostic) برای وجود موتاسیون‌ها در ژنوم انسانی ، یا برای وارد کردن جهش‌های ویژه به داخل ژن همسانه شده ، استفاده کرد.

PCR بطور دستی و با قرار دادن پر زحمت و انتقال لوله‌های آزمایش بین حمام‌های آب دارای دمای لازم ، بوجود آمد. امروزه دستگاههایی بطور تجارتی تهیه می‌شوند که در آنها جایگاههای لوله‌ای با بلوک فلزی حرارت پذیر تعبیه شده است و قابل برنامه ریزی برای تغییر سریع بین دماهای لازم است. n چرخه PCR ، DNAی مورد نظر را 2n بار تکثیر می‌کند.